Pagrindinis skirtumas - šiaurinis vs pietinis ir vakarinis blotingas
Specifinių DNR, RNR ir baltymų sekų nustatymas yra būtinas atliekant įvairius molekulinės biologijos tyrimus. Gelio elektroforezė yra metodika, atskirianti DNR, RNR ir baltymus pagal jų dydį. Iš gelio profilių tam tikra DNR seka, RNR seka ar baltymai nustatomi specialiais metodais, vadinamais blotavimu ir hibridizacija su žymėtais zondais. Yra trys skirtingi blotavimo metodai, būtent pietų, šiaurės ir vakarų. Pagrindinis skirtumas tarp šiaurinio pietų ir vakarų blotingo yra molekulės, kurią ji aptinka iš mėginio, tipas. Southern blotingas yra metodas, kuris nustato specifinę DNR seką iš DNR mėginio. Northern blotting yra metodas, kuris nustato specifinę RNR seką iš RNR mėginio.„Western blotting“yra metodas, nustatantis specifinį baltymą iš baltymo mėginio.
TURINYS
1. Apžvalga ir pagrindiniai skirtumai
2. Kas yra „Southern Blotting“
3. Kas yra „Northern Blotting“
4. Kas yra „Western Blotting“
5. Palyginimas vienas šalia kito - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Santrauka
Kas yra „Southern Blotting“?
„Southern blotting“technika buvo sukurta „EM Southern“1975 m., Siekiant identifikuoti specifinę DNR seką iš DNR mėginio. Tai yra pirmoji molekulinės biologijos metodika. Tai leido aptikti specifinius genus iš DNR, specifinius fragmentus iš DNR ir kt. Pietinio blotingo technika yra keli etapai. Jie yra tokie.
- DNR išskiriama iš mėginio ir suardoma restrikcijos endonukleazėmis.
- Virškinamas mėginys atskiriamas agarozės gelio elektroforeze.
- DNR fragmentai gelyje yra denatūruojami į atskiras sruogas naudojant šarminį tirpalą.
- Vienos grandinės DNR perkeliama į nitroceliuliozės filtro membraną perkeliant kapiliarus.
- Perkelta DNR visam laikui fiksuojama ant membranos.
- Fiksuota DNR ant membranos yra hibridizuojama su žymėtais zondais.
- Nesurišta DNR plaunama nuo membranos.
- Rentgeno plėvelė eksponuojama membranoje ir paruošiamas autoradiografas.
Southern blotingas taikomas įvairiems molekulinės biologijos aspektams. Tai naudinga atliekant RFLP kartografavimą, kriminalistinius tyrimus, DNR metilinimą genų raiškoje, mutavusių genų nustatymą esant genetiniams sutrikimams, DNR pirštų atspaudus ir kt.
01 pav. „Southern Blotting“technika
Kas yra „Northern Blotting“?
Northern blotting yra metodas, skirtas nustatyti specifinę RNR seką arba mRNR seką iš mėginio, siekiant ištirti genų ekspresiją. Šią techniką sukūrė Alwine'as, Kempas ir Starkas 1979 m. Ji skiriasi nuo šaltinio ir vakarų blotingo technikos dėl kelių žingsnių. Tačiau ši technika taip pat atliekama naudojant elektroforezę geliu, blotavimą ir hibridizaciją su specialiai pažymėtais zondais ir nustatant. Northern blotting technika atliekama taip.
- RNR ekstrahuojama iš mėginio ir atskiriama gelio elektroforeze.
- RNR iš gelio perkeliama ant blotingo membranos ir fiksuojama.
- Membrana apdorojama pažymėtu zondu, paruoštu iš cDNR arba RNR (zondas papildo tam tikrą mėginio seką).
- Zondas inkubuojamas su membrana, kad susietų su tam tikra seka.
- Nesurišti zondai nuplaunami.
- Hibridizuoti fragmentai aptinkami autoradiografu.
Northern blotting yra svarbi priemonė nustatant ir kiekybiškai įvertinant hibridizuotą iRNR, tiriant RNR degradaciją, vertinant RNR pusperiodį, nustatant RNR splaisingą, tiriant genų ekspresiją ir kt.
02 paveikslas: Šiaurės blotingas
Kas yra „Western Blotting“?
Western blotingas yra metodas nustatyti specifinį baltymą iš baltymų mišinio naudojant žymėtus antikūnus. Todėl Western blot taip pat žinomas kaip imunoblotas. Šią techniką Towbinas ir kt. Pristatė 1979 m. Ir dabar ji paprastai atliekama baltymų analizės laboratorijose. Veiksmai yra tokie.
- Iš mėginio ekstrahuojami baltymai
- Baltymai atskiriami pagal dydį, naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę
- Atskirtos molekulės elektroporacijos būdu perkeliamos į PVDF membraną arba nitroceliuliozės membraną
- Membrana blokuojama nespecifiniam prisijungimui prie antikūnų
- Perkelti baltymai surišami su pirminiais antikūnais (fermentais pažymėti antikūnai).
- Membrana plaunama, kad būtų pašalinti nespecifiškai susieti pirminiai antikūnai
- Susieti antikūnai nustatomi pridedant substratą ir nustatant susidariusias spalvotas nuosėdas
Western blotingas yra naudingas nustatant anti-ŽIV antikūnus žmogaus serumo mėginyje. Western blot taip pat gali būti naudojamas kaip patvirtinamasis hepatito B infekcijos tyrimas ir galutinis pašėlusių karvių ligos testas.
03 pav. „Western Blotting“
Kuo skiriasi „Northern Southern“ir „Western Blotting“?
Skirtingas straipsnis viduryje prieš lentelę
Šiaurės vs Pietų vs Vakarų Blotting |
|
| Aptiktos molekulės tipas | |
| Šiaurės Blotingas | Northern blotting iš RNR mėginio nustato specifinę RNR seką. |
| Southern Blotting | Southern blotting iš DNR mėginio nustato specifinę DNR seką. |
| Western Blotting | Western blotting iš baltymo mėginio aptinka specifinį baltymą. |
| Gelio tipas | |
| Šiaurės Blotingas | Tam naudojamas agarozės / formaldehido gelis. |
| Southern Blotting | Tam naudojamas „Agarose“gelis. |
| Western Blotting | Tam naudojamas poliakrilamido gelis. |
| Blotingo metodas | |
| Šiaurės Blotingas | Tai yra kapiliarų perkėlimas. |
| Southern Blotting | Tai yra kapiliarų perkėlimas. |
| Western Blotting | Tai yra elektros perdavimas. |
| Naudoti zondai | |
| Šiaurės Blotingas | cDNR arba RNR zondai, pažymėti radioaktyviai arba neradioaktyviai. |
| Southern Blotting | DNR zondai žymimi radioaktyviai arba neradioaktyviai. |
| Western Blotting | Pirminiai antikūnai naudojami kaip zondai. |
| Aptikimo sistema | |
| Šiaurės Blotingas | Tai atliekama naudojant autoradiografą arba nustatant šviesos ar spalvos pokyčius. |
| Southern Blotting | Tai atliekama naudojant autoradiografą, nustatant šviesos ar spalvos pokyčius. |
| Western Blotting | Tai daroma naudojant šviesos ar spalvos pokyčių aptikimą. |
Santrauka - Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotavimas yra speciali technika, sukurta identifikuoti specifinę DNR, RNR ar baltymą iš mėginių. Tam tikros rūšies molekulei aptikti yra trys atskiros blotavimo procedūros, būtent šiaurinė, pietinė ir vakarinė. Šiaurinio blotingo technika yra skirta nustatyti specifinę RNR seką iš RNR mišinio. Southern blot technika leidžia nustatyti specifinę DNR seką iš DNR mėginio, o Western blot technika sukurta tam, kad būtų galima identifikuoti specifinį baltymą iš baltymų mišinio.
