Pagrindinis skirtumas - klonavimas ir subklonavimas
Klonavimas ir subklonavimas yra molekulinės biologinės procedūros, kurios sukuria genetiškai identiškas ląsteles ar organizmus, turinčius dominančią DNR ar geną. Klonavimas yra metodas, apimantis susidomėjusio geno ar DNR įterpimą į vektorių, jo replikaciją per šeimininko bakteriją ir ląstelių ar organizmų, kurie yra tikslios genetinės struktūros kopijos, gamybą. Subklonavimas yra metodas, apimantis dominančio geno, kuris jau yra įterptas į vektorių, įterpimą į antrinį vektorių, jo replikaciją per šeimininko bakteriją ir genetiškai identiškų ląstelių ar organizmų kopijų gamybą. Pagrindinis skirtumas tarp klonavimo ir subklonavimo yra tas, kad klonuojant dominantis genas, susietas į vektorių, tęsia klonavimo procesą, o subklonuodamasjau klonuotas dominantis genas yra atskiriamas nuo pirminio vektoriaus ir vėl įterpiamas į recipiento vektorių ir tęskite procesą.
TURINYS
1. Apžvalga ir pagrindiniai skirtumai
2. Kas yra klonavimas
3. Kas yra subklonavimas
4. Palyginimas greta - klonavimas ir subklonavimas
5. Santrauka
Kas yra klonavimas?
Klonavimas yra procedūra, kurios metu gaunami genetiškai identiški organizmai ar ląstelės. Gamtoje klonavimas vyksta nelytinio dauginimosi priemonėmis. Kai nėra genetinės rekombinacijos ar pakeitimo, dukterinės ląstelės gauna tą patį tėvų genetinį makiažą. Prokariotiniai ir eukariotiniai organizmai sukuria klonus dvejetainiu dalijimusi, pumpuravimuisi, mitozei ir kt. Molekulinėje biologijoje genų ar specifinių DNR fragmentų klonavimas yra populiarus metodas tiriant tos konkrečios DNR sekcijos struktūrą ir funkciją.
Pagrindinis molekulinio klonavimo tikslas yra padaryti milijonus genetiškai identiškų ląstelių ar organizmų, turinčių dominantį DNR fragmentą (daugiausia genų), kopijų. Tai sukuria organizmus su tiksliomis kito genetinėmis kopijomis. Pirmiausia specifiniai genai klonuojami atliekant molekulinius tyrimus, siekiant gauti struktūrinę ir funkcinę informaciją bei nustatyti DNR seką. Be to, klonavimas plačiai naudojamas specifinių baltymų ar produktų gamybai.
Klonavimo procedūra
Pagrindiniai klonavimo procedūros etapai yra šie.
- Dominančio geno identifikavimas ir išskyrimas. (Dominančio geno amplifikacija atliekant PGR).
- Ribojančio dominančio geno virškinimas (restrikcijos endonukleazė nutraukė geną).
- Ribojantis vektoriaus DNR virškinimas. (Vektorinė DNR taip pat supjaustoma naudojant tą pačią restrikcijos endonukleazę).
- Geno įterpimas į vektorių ir rekombinantinės molekulės susidarymas.
- Rekombinantinio vektoriaus transformacija į šeimininko bakteriją.
- Transformuotų bakterijų išskyrimas ir identifikavimas (plazmidės vektoriuje turėtų būti pasirenkamas genas, dažniausiai atsparumo antibiotikams genas, skirtas atrinkti transformuotas bakterijas).
- Rekombinantinio geno ekspresija šeimininko viduje.
01 pav.: Klonavimo procedūra
Kas yra subklonavimas?
Subklonavimas yra procedūra, pagal kurią dominantis genas perkeliamas iš vieno vektoriaus į kitą, kad būtų galima pamatyti geno išraišką, norint įgyti norimą geno funkcionalumą. Taikant šį metodą, dalyvauja du vektoriai; būtent pirminis vektorius ir paskirties vektorius. Klonuoti intarpai vėl perkeliami į antrą vektorių subklonuojant. Geno perkėlimo iš pirmojo vektoriaus į antrąjį vektoriaus tikslas yra gauti tai, ko negalėjo padaryti pirmasis vektorius, arba atskirti geną jau klonuotame DNR fragmente ir jį ekspresuoti atskirai. Pradžioje šioje procedūroje naudojami ribojimo fermentai.
Subklonavimo procedūra
Pagrindiniai subklonavimo žingsniai yra tokie.
- Naudojant restrikcijos endonukleazes, išskiriama dominanti DNR donoro plazmidėje (pirminis vektorius).
- Dominančios DNR amplifikacija naudojant PGR.
- PGR produkto (dominančios DNR) gryninimas elektroforeze geliu.
- Gavėjo plazmidės atidarymas tomis pačiomis restrikcijos endonukleazėmis, naudojamomis atskiriant pirminę plazmidę dominančią DNR.
- Dominančios DNR (geno) susiejimas su recipiento plazmide, siekiant sukurti subklonuotą plazmidę.
- Subklonuoto vektoriaus transformacija į kompetentingą šeimininko bakteriją.
- Transformuotų ląstelių atranka.
- Plazmidinės DNR gryninimas ir naudojimas DNR sekvenavimui ar genų ekspresijai, norint gauti norimus produktus.
Subklonavimas atliekamas tuo atveju, kai vienas genas išskiriamas iš klonuotų genų grupės, arba kai norimas genas turi būti perkeltas į naudingą plazmidę, kad būtų galima pamatyti tikslią dominančio geno funkciją.
02 pav.: Subklonavimo procedūra
Koks skirtumas tarp klonavimo ir subklonavimo?
Skirtingas straipsnis viduryje prieš lentelę
Klonavimas vs subklonavimas |
|
| Klonavimas yra procedūra, kurios metu gaunami genetiškai identiški organizmai ar ląstelės. | Subklonavimas yra procedūra, pagal kurią dominantis genas perkeliamas iš vieno vektoriaus į kitą, kad būtų galima pamatyti geno išraišką, norint įgyti norimą geno funkcionalumą. |
| Procesas | |
| Atskirkite norimą organizmo DNR nuo organizmo ir vieną kartą įkiškite į vektorių ir klonuokite | Jau klonuota DNR atskiriama nuo pirmojo vektoriaus, įterpiama į antrąjį vektorių ir klonuojama. |
| Įterpkite judėjimą per vektorius | |
| Nejudina intarpų (dominančios DNR) iš vieno vektoriaus į kitą. | Perkelkite įdėklus iš pirminio vektoriaus į paskirties vektorių. |
Santrauka - klonavimas ir subklonavimas
Klonavus sukuriamos genetiškai identiškos ląstelės ar organizmai su įdėtu genu ar DNR, kuris domina. Ji vyksta atskiriant ir įterpiant dominančią DNR į vektorių ir ekspresuojant šeimininkės bakterijoje. Subklonavimas turi panašius veiksmus kaip ir klonavimas. Tačiau subklonuojant jau klonuotas DNR fragmentas (dominantis genas) įterpiamas į vektorių ir transformuojamas į šeimininko bakteriją. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp klonavimo ir subklonavimo.
