Pagrindinis skirtumas - Sanger sekos ir pirosekvenavimas
DNR seka yra labai svarbi DNR analizei, nes žinant teisingą nukleotidų išsidėstymą konkrečiame DNR regione, paaiškėja daug svarbios informacijos apie tai. Yra skirtingi DNR sekos nustatymo metodai. Sanger sekvenavimas ir pirosekvenavimas yra du skirtingi DNR sekvenavimo metodai, plačiai naudojami molekulinėje biologijoje. Pagrindinis skirtumas tarp „Sanger“sekos ir pirosekvenavimo yra tas, kad „Sanger“sekvencijoje naudojami dideoksinukleotidai, siekiant nutraukti DNR sintezę, kad būtų galima perskaityti nukleotidų seką, o pirosekvenavimas nustato pirofosfato išsiskyrimą, įtraukdamas nukleotidus ir sintezuodamas komplementinę seką, kad būtų galima nuskaityti tikslią sekos tvarką.
TURINYS
1. Apžvalga ir pagrindiniai skirtumai
2. Kas yra Sanger sekos nustatymas
3. Kas yra Pirosekvenavimas
4. Palyginimas vienas šalia kito - Sanger sekos ir Piros sekos
5. Santrauka
Kas yra sekerių seka?
„Sanger“sekos nustatymas yra pirmosios kartos DNR sekos nustatymo metodas, kurį sukūrė Frederickas Sangeris ir jo kolegijos 1977 m. Jis taip pat žinomas kaip grandinės nutraukimo seka arba dideoksi sekvenavimas, nes jis pagrįstas grandinės nutraukimu dideoksinukleotidais (ddNTP). Šis metodas buvo plačiai naudojamas daugiau nei 30 metų, kol buvo sukurta naujos kartos sekvencija (NGS). Sanger sekvenavimo technika leido rasti teisingą nukleotidų eilę arba pritvirtinti konkretų DNR fragmentą. Tai pagrįsta selektyviu ddNTP įtraukimu ir DNR sintezės nutraukimu in vitro DNR replikacijos metu. 3'OH grupių nebuvimas siekiant tęsti fosfodiesterio ryšį tarp gretimų nukleotidų yra unikalus ddNTP bruožas. Taigi, prisijungus ddNTP, grandinės pailgėjimas nutrūksta ir baigiasi nuo to taško. Yra keturi ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP ir ddTTP - naudojami Sanger sekvenavime. Šie nukleotidai sustabdo DNR replikacijos procesą, kai jie yra įterpiami į augančią DNR grandinę ir lemia įvairaus ilgio trumpą DNR. Kapiliarinio gelio elektroforezė naudojama organizuojant šias trumpas DNR grandines pagal jų dydį ant gelio, kaip parodyta 01 paveiksle.
1 paveikslas: Sintetintos trumpos DNR kapiliarinio gelio elektroforezė
Norint DNR replikuoti in vitro, turėtų būti pateikti keli reikalavimai. Tai yra DNR polimerazės fermentas, DNR matrica, oligonukleotidų pradmenys ir deoksinukleotidai (dNTP). Sanger sekvenuojant, DNR replikacija atliekama keturiuose atskiruose mėgintuvėliuose kartu su keturių tipų ddNTP atskirai. Deoksinukleotidai nėra visiškai pakeisti atitinkamais ddNTP. Konkretaus dNTP mišinys (pavyzdžiui; dATP + ddATP) yra įtrauktas į mėgintuvėlį ir pakartojamas. Keturiuose atskiruose mėgintuvėlių produktuose gelis naudojamas keturiuose atskiruose šuliniuose. Tada, perskaičius gelį, galima sukonstruoti seką, kaip parodyta 02 paveiksle.
02 paveikslas: Sanger sekos
Sangerio sekos yra svarbi technika, padedanti daugelyje molekulinės biologijos sričių. Žmogaus genomo projektas buvo sėkmingai užbaigtas naudojant Sanger sekvenavimo metodus. Sanger sekvenavimas taip pat naudingas atliekant tikslinių DNR sekų nustatymą, vėžio ir genetinių ligų tyrimus, genų ekspresijos analizę, žmogaus identifikavimą, patogenų aptikimą, mikrobų sekos nustatymą ir kt.
Yra keletas Sanger sekos trūkumų:
- Sekvenuojamos DNR ilgis negali būti ilgesnis nei 1000 bazių porų
- Vienu metu gali būti sekvenuojama tik viena grandinė.
- Procesas užima daug laiko ir yra brangus.
Todėl laikui bėgant buvo sukurtos naujos pažangios sekos nustatymo technikos šioms problemoms įveikti. Tačiau „Sanger“sekvenavimas vis dar naudojamas dėl labai tikslių rezultatų iki maždaug 850 bazinės poros ilgio fragmentų.
Kas yra pirosekvenavimas?
Pirosekvenavimas yra nauja DNR sekvenavimo technika, pagrįsta „sekos sintezės būdu“. Ši technika remiasi pirofosfato išsiskyrimo nustatymu, įsijungus nukleotidams. Procesą naudoja keturi skirtingi fermentai: DNR polimerinė, ATP sulfurilazė, luciferazė ir apirazė ir du substratai adenozino 5 'fosfosulfatas (APS) ir liuciferinas.
Procesas prasideda nuo to, kad pradmuo jungiasi su viengrandžiu DNR šablonu, o DNR polimerazė pradeda inkorporuoti jam komplementarius nukleotidus. Nukleotidams susijungus (nukleorūgščių polimerizacija), išsiskiria pirofosfato (dvi kartu sujungtos fosfatų grupės) grupės ir energija. Kiekvienas nukleotidų junginys išskiria ekvimolinį kiekį pirofosfato. Pirofosfatas virsta ATP ATP sulfurilazės pagalba, esant substrato APS. Sukurtas ATP skatina liuciferazės sukeltą luciferino konversiją į oksiluciferiną, sukuriant matomą šviesą proporcingai ATP kiekiui. Šviesa aptinkama fotonų aptikimo įtaisu arba daugikliu ir sukuriama pirograma. Apirazė suardo reakcijos mišinyje ATP ir neįtrauktus dNTP. dNTP pridedama vieną kartą. Kadangi nukleotido pridėjimas yra žinomas atsižvelgiant į šviesos įterpimą ir aptikimą, galima nustatyti šablono seką. Pirograma naudojama mėginio DNR nukleotidų sekai generuoti, kaip parodyta 03 paveiksle.
Pirosekvenavimas yra labai svarbus atliekant vieno nukleotidų polimorfizmo analizę ir sekvenuojant trumpus DNR ruožus. Didelis tikslumas, lankstumas, paprastas automatizavimas ir lygiagretus apdorojimas yra pirosekvenavimo pranašumai, palyginti su „Sanger“sekos nustatymo metodais.
03 pav. Pirosekvenavimas
Koks skirtumas tarp Sanger sekos ir pirosekvenavimo?
Skirtingas straipsnis viduryje prieš lentelę
Sanger sekos ir pirosekvenavimas |
|
| Sanger sekvenavimas yra DNR sekos nustatymo metodas, pagrįstas selektyviu ddNTP įtraukimu DNR polimerazės būdu ir grandinės nutraukimu. | Pirosekvenavimas yra DNR sekos nustatymo metodas, pagrįstas pirofosfato išsiskyrimo nustatymu įterpus nukleotidą. |
| DdNTP naudojimas | |
| DNR replikacijai nutraukti naudojami ddNTP | ddNTP nenaudojami. |
| Dalyvauja fermentai | |
| Naudojama DNR polimerazė. | Naudojami keturi fermentai: DNR polimerazė, ATP sulfurilazė, liuciferazė ir Apirazė. |
| Naudoti substratai | |
| APS ir Luciferinas nenaudojami. | Naudojamas adenozino 5 ’fosfosulfatas (APS) ir liuciferinas. |
| Maksimali temperatūra | |
| Tai lėtas procesas. | Tai greitas procesas. |
Santrauka - Sanger sekos palyginimas su pirosequencing
Sanger sekvenavimas ir pirosekvenavimas yra du DNR sekvenavimo metodai, naudojami molekulinėje biologijoje. „Sanger“sekvenavimas konstruoja nukleotidų eilės tvarką nutraukdamas grandinės pailgėjimą, o pirosekvenavimas nustato tikslią sekos nukleotidų eilės tvarką, įtraukdamas nukleotidus ir nustatydamas pirofosfatų išsiskyrimą. Todėl pagrindinis skirtumas tarp „Sanger“sekos ir pirosekvenavimo yra tas, kad „Sanger“sekvenavimas veikia seką grandinės nutraukimu, o pirosekvenavimas - sintezės būdu.
