Pagrindinis skirtumas - NGS ir Sanger sekos
Naujos kartos sekvenavimas (NGS) ir Sangerio sekvenavimas yra dviejų tipų nukleotidų sekos nustatymo metodai, sukurti laikui bėgant. „Sanger Sequencing“metodas buvo plačiai naudojamas daugelį metų, o NGS neseniai pakeitė jį dėl savo pranašumų. Pagrindinis skirtumas tarp NGS ir „Sanger“sekvenavimo yra tas, kad NGS veikia tuo pačiu principu, kad vienu metu greitai nustatomos milijoninės sekos per sekvenavimo sistemą, o „Sanger“sekos - grandinės nutraukimo principas dėl selektyvaus dideoksinukleotidų įtraukimo į DNR polimerazės fermentą DNR replikacijos metu ir dėl to fragmentų atskyrimo atliekant kapiliarinę elektroforezę.
TURINYS
1. Apžvalga ir pagrindiniai skirtumai
2. Kas yra nukleotidų sekos nustatymas
3. Kas yra NGS
4. Kas yra Sanger sekvenavimas
5. Gretimas palyginimas - NGS ir Sanger sekos nustatymas
6. Santrauka
Kas yra nukleotidų sekos nustatymas?
Genetinė informacija yra saugoma organizmo DNR arba RNR nukleotidų sekose. Teisingos nukleotidų eilės nustatymo procesas (naudojant keturias bazes) tam tikrame fragmente (gene, genų grupėje, chromosomoje ir visiškame genome) yra žinomas kaip nukleotidų sekos nustatymas. Genomikos, teismo ekspertizės, virusologijos, biologinės sisteminės, medicininės diagnostikos, biotechnologijų ir daugelyje kitų sričių analizuoti genų struktūrą ir funkciją yra labai svarbu. Yra įvairių tipų sekos nustatymo metodų, kuriuos sukūrė mokslininkai. Tarp jų Fredericko Sangerio sukurta „Sanger“sekvencija buvo plačiai naudojama ir populiarinama ilgą laiką, kol „Next Generation Sequencing“ją pakeitė.
Kas yra NGS?
Naujos kartos sekvenavimas (NGS) yra terminas, vartojamas šiuolaikiniams didelio našumo sekvenavimo procesams nurodyti. Jame aprašomos įvairios šiuolaikinės sekvenavimo technologijos, kurios pakeitė genominius tyrimus ir molekulinę biologiją. Tos technikos yra „Illumina“sekos, „Roche 454“, „Ion Proton“ir „SOLiD“(„Sequencing by Oligo Ligation Detection“) sekos. NGS sistemos yra greitesnės ir pigesnės. NGS sistemose naudojami keturi pagrindiniai DNR sekos nustatymo metodai: pirosekvenavimas, sekos sintezės būdu, sekos susiejimas ir jonų puslaidininkių sekvenavimas. Daugelis DNR arba RNR grandinių (milijonai) gali būti sekvenuojamos lygiagrečiai. Tai leidžia sekvencuoti visą organizmų genomą per trumpą laiką, skirtingai nuo Sanger sekvenavimo, kuris užima daugiau laiko.
NGS turi daug privalumų, palyginti su įprastu sekos Sangerio metodu. Tai greitas, tikslesnis ir ekonomiškesnis procesas, kurį galima atlikti su mažu imties dydžiu. NGS gali būti naudojama atliekant metagenominius tyrimus, nustatant individualaus genomo variacijas dėl intarpų ir delecijų ir pan., Taip pat analizuojant genų raišką.
_1 paveikslas: NGS sekos pokyčiai
Kas yra sekerių seka?
Sanger sekvenavimas yra Fredericko Sangerio ir jo kolegų 1977 metais sukurtas sekos nustatymo metodas, siekiant nustatyti tikslią tam tikros DNR fragmento nukleotidų eilės tvarką. Jis taip pat žinomas kaip grandinės nutraukimo seka arba didideoksi sekvenavimas. Šio metodo veikimo principas yra grandinės sintezės nutraukimas selektyviai įtraukiant grandinę, baigiantį dideoksinukleotidus (ddNTP), tokius kaip ddGTP, ddCTP, ddATP ir ddTTP, DNR polimerazės metu DNR replikacijos metu. Normalūs nukleotidai turi 3 ’OH grupes, kad susidarytų fosfodiesterinis ryšys tarp gretimų nukleotidų, kad būtų tęsiamas grandinės susidarymas. Tačiau ddNTP trūksta šios 3 'OH grupės ir jie negali sukurti fosfodiesterinių ryšių tarp nukleotidų. Vadinasi, grandinės pailgėjimas nutrūksta.
Taikant šį metodą, vienos grandinės DNR, kuri bus sekvenuota, tarnauja kaip šablono grandinė DNR sintezei in vitro. Kiti reikalavimai yra oligonukleotidų pradmenys, deoksinukleotidų pirmtakai ir DNR polimerazės fermentas. Kai žinomi taikinio fragmento šoniniai galai, pradmenis galima lengvai sukurti DNR replikacijai. Keturiuose atskiruose mėgintuvėliuose atliekamos keturios atskiros DNR sintezės reakcijos. Kiekviename mėgintuvėlyje yra atskiri ddNTP, kartu su kitais reikalavimais. Iš konkretaus nukleotido pridedamas dNTP ir ddNTP mišinys. Taip pat keturios atskiros reakcijos atliekamos keturiuose mėgintuvėliuose su keturiais mišiniais. Po reakcijų atliekamas DNR fragmentų aptikimas ir fragmento modelio pavertimas informacija apie seką. Gauti DNR fragmentai yra denatūruojami ir atskiriami elektroforeze geliu. Jei naudojami radioaktyvūs nukleotidai, juostos raštą poliakrilamido gelyje galima vizualizuoti autoradiografijos būdu. Kai taikant šį metodą naudojami fluorescenciškai pažymėti dideoksinukleotidai, jį galima sušvelninti nuskaitytu geliu ir perduoti per lazerio spindulį, kurį turi aptikti fluorescencinis detektorius. Kad išvengtumėte klaidų, kurios gali kilti, kai seka yra skaitoma akimi ir įvedama rankiniu būdu į kompiuterį, šis metodas buvo sukurtas naudojant automatizuotą sekvencerį kartu su kompiuteriu. Kad išvengtumėte klaidų, kurios gali kilti, kai seka yra skaitoma akimi ir įvedama rankiniu būdu į kompiuterį, šis metodas buvo sukurtas naudojant automatizuotą sekvencerį kartu su kompiuteriu. Kad būtų išvengta klaidų, kurios gali kilti, kai seka yra skaitoma akimi ir įvedama rankiniu būdu į kompiuterį, šis metodas buvo sukurtas naudojant automatizuotą sekvencerį kartu su kompiuteriu.
Tai metodas, naudojamas DNR sekai iš žmogaus genomo projekto. Šis metodas vis dar naudojamas su išplėstinėmis modifikacijomis, nes jis suteikia tikslią sekos informaciją, nepaisant to, kad tai brangus ir lėtas procesas.
_2 pav.: Sanger sekos
Kuo skiriasi NGS ir „Sanger Sequencing“?
Skirtingas straipsnis viduryje prieš lentelę
NGS vs Sanger sekos |
|
| Naujos kartos sekvenavimas (NGS) reiškia šiuolaikinius didelio našumo sekvenavimo procesus. Jame aprašoma daugybė skirtingų šiuolaikinių sekos technologijų | Sanger sekvenavimas yra Fredericko Sangerio sukurtas sekos nustatymo metodas, siekiant nustatyti tikslią tam tikros DNR fragmento nukleotidų eilės tvarką. |
| Kainos efektyvumas | |
| NGS yra pigesnis procesas, nes jis sumažina laiką, žmogaus galią ir chemikalus. | Tai brangus procesas, nes tam reikia laiko, žmogaus jėgos ir daugiau chemikalų. |
| Greitis | |
| Tai yra greičiau, nes cheminis ir daugelio krypčių signalų aptikimas vyksta lygiagrečiai. | Tai užima daug laiko, nes cheminis aptikimas ir signalo aptikimas vyksta kaip du atskiri procesai ir vienu metu gali skaityti tik grandinės. |
| Patikimumas | |
| NGS yra patikima. | Sanger sekos yra mažiau patikimos |
| Imties dydis | |
| NGS reikia mažiau DNR. | Šiam metodui reikia didelio kiekio DNR šablono. |
| DNR bazės vienam sekos fragmentui | |
| DNR bazių skaičius vienam sekvenuotam fragmentui yra mažesnis nei Sangerio metodo | Generuojamos sekos yra ilgesnės nei NGS sekos. |
Santrauka - NGS ir Sanger sekos
NGS ir Sanger sekvenavimas yra nukleotidų sekos nustatymo metodai, plačiai naudojami molekulinėje biologijoje. Sanger sekvenavimas yra ankstyvas sekvenavimo metodas, kurį pakeitė NGS. Pagrindinis skirtumas tarp NGS ir „Sanger Sequencing“yra tas, kad NGS yra greitas, tikslesnis ir ekonomiškesnis procesas nei „Sanger“sekos nustatymas. Abi technikos sukėlė didelius genetikos ir biotechnologijų protrūkius.
