Pagrindinis skirtumas - PGR ir DNR sekos nustatymas
PGR ir DNR sekos yra du svarbūs molekulinės biologijos metodai. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra procesas, sukuriantis daug DNR fragmento kopijų. DNR sekos nustatymas yra technika, kurios rezultatas yra tiksli tam tikros DNR fragmento nukleotidų tvarka. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp PGR ir DNR sekos. PGR yra vienas pagrindinių DNR sekos nustatymo etapų.
TURINYS
1. Apžvalga ir pagrindiniai skirtumai
2. Kas yra PGR
3. Kas yra DNR sekos nustatymas
4. Palyginimas greta - PGR ir DNR sekos nustatymas
5. Santrauka
Kas yra PGR?
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra DNR amplifikacijos technika, naudojama molekulinėje biologijoje. Jis gamina tūkstančius iki milijonų konkretaus DNR fragmento kopijų. Šį metodą sukūrė Kary Mullis 1983 m. Taikant šią metodiką, amplifikuojamas DNR fragmentas tarnauja kaip šablonas, o DNR polimerazės fermentas prideda papildomus nukleotidus prie pradmens, kuris yra PCR mišinyje. PGR reakcijos pabaigoje susintetinama daug mėginio DNR kopijų.
Yra skirtingi PGR mišinio komponentai, įskaitant DNR, DNR polimerazę (Taq polimerazę), pradmenis (pirmyn ir atgal nukreiptus pradmenis), nukleotidus (DNR statybines medžiagas) ir buferį. PGR vyksta PGR mašinoje, į mašiną reikia įkelti teisingą PGR mišinį ir valdyti teisingą programą. Ši technika leidžia pagaminti tūkstančius iki milijonų tam tikros DNR dalies kopijų iš labai mažo DNR kiekio.
PGR reakcijos vyksta cikliškai, kad ant gelio susidarytų matomas PCR produktų kiekis. Yra trys pagrindiniai PGR reakcijos etapai, būtent denatūravimas, grunto atkaitinimas ir gijos pratęsimas, kaip parodyta 01 paveiksle. Šie trys etapai vyksta esant trims skirtingoms temperatūroms. DNR egzistuoja dvigubos grandinės pavidalu tarp vandenilio ryšių tarp papildomų bazių. Prieš implikaciją dvigubos grandinės DNR reikia atskirti viena nuo kitos. Tai daroma suteikiant aukštą temperatūrą. Esant aukštai temperatūrai, dvigubos grandinės DNR denatūruojasi į vijas. Tada pradmenys turėtų priartėti prie konkretaus fragmento arba DNR geno šoninių galų. Primer yra trumpas vienos grandinės DNR gabalas, papildantis tikslinę seką. Pirmyn ir atgal pradmenys atkaitina komplementarias bazes denatūruoto mėginio DNR šoniniuose galuose atkaitinimo temperatūroje. Gruntai turėtų būti atsparūs karščiui. Kai pradmenys atkaitina DNR mėginį, taq polimerazės fermentas pradeda naujų grandinių sintezę, pridedant nukleotidų, kurie papildo tikslinę DNR. Taq polimerazė yra termiškai stabilus fermentas, išskiriamas iš termofilinės bakterijos, vadinamos Thermus aquaticus. PGR buferis palaiko optimalias taq polimerazės veikimo sąlygas. Šie trys PGR reakcijų etapai kartojami, kad gautų reikiamą PGR produkto kiekį. Po kiekvienos PGR reakcijos DNR kopijos skaičius padvigubėja. Taigi atliekant PGR galima pastebėti eksponentinę amplifikaciją. PGR produktus galima stebėti naudojant elektroforezę geliu ir juos galima išvalyti tolesniems tyrimams.
01 pav. Pagrindiniai PGR reakcijos žingsniai
PGR yra vertinga medicinos ir biologinių tyrimų priemonė. PGR turi ypatingą vertę teismo medicinos srityje, nes jis gali sustiprinti DNR tyrimams iš mažų nusikaltėlių mėginių ir sukurti teismo DNR profilius. PGR yra plačiai naudojamas daugelyje molekulinės biologijos sričių, įskaitant genotipų nustatymą, genų klonavimą, mutacijų aptikimą, DNR sekos nustatymą, DNR mikrodaleles ir tėvystės tyrimus ir kt.
02 pav. Polimerazės grandininė reakcija
Kas yra DNR sekos nustatymas?
DNR sekos nustatymas yra tiksli nukleotidų - adenino, guanino, citozino ir timino tvarka tam tikrame DNR fragmente. Genetinė informacija saugoma DNR sekose, naudojant teisingą nukleotidų tvarką. Taigi norint sužinoti tikslią nukleotidų eilę DNR fragmente, reikia žinoti apie genų struktūrą ir funkciją.
DNR sekvenavimo protokolas apima skirtingus procesus. Pirmasis žingsnis yra suinteresuotos DNR ar genomo DNR išskyrimas. Naudojant PGR (kaip aprašyta aukščiau), norimas DNR regionas turėtų būti sustiprintas. Sustiprintas PGR produktas turi būti atskirtas elektroforezės būdu ir išgrynintas. Sustiprinti fragmentai pateikiami kaip sekos šablonai. Sekvencija gali būti atliekama sekant Sanger sekos nustatymo metodu arba naudojant didelio našumo sekvenavimo metodą. Sanger sekvenavimui reikalinga gautų DNR fragmentų kapiliarinė elektroforezė. Teisingą nukleotidų eiliškumą galima nustatyti rankiniu būdu nuskaitant autoradiografus arba naudojant automatinius DNR sekvencerius.
Genų sekos prisidėjo prie žmogaus genomo projekto ir palengvino žmogaus genomo kartografavimą 2003 m. Kriminalistikoje DNR sekos leido identifikuoti asmenis, turinčius unikalias DNR sekas ir nustatyti nusikaltėlius. Medicinoje DNR seka gali būti naudojama norint nustatyti genus, atsakingus už genetines ir kitas ligas, rasti defektinius genus ir pakeisti juos teisingais. Žemės ūkyje kai kurių mikroorganizmų DNR sekos informacija naudojama norint sukurti ekonomiškai pageidaujamas transgenines kultūras.
03 paveikslas: DNR sekos nustatymas
Kuo skiriasi PGR ir DNR sekos nustatymas?
Skirtingas straipsnis viduryje prieš lentelę
PGR ir DNR sekos nustatymas |
|
| PGR procesas sukuria tūkstančius iki milijonų suinteresuoto DNR fragmento kopijų. | DNR sekos nustatymas yra procesas, kurio metu nustatoma tiksli nukleotidų tvarka tam tikrame DNR fragmente. |
| Rezultatas | |
| PGR sukuria tūkstančius iki milijonų konkretaus DNR fragmento kopijų | Taip gaunama teisinga tam tikro DNR fragmento bazių tvarka. |
| DdNTP įtraukimas | |
| PGR nereikia ddNTP. Jis naudoja dNTP. | DNR sekos nustatymui reikia ddNTP, kad būtų nutrauktas grandinės susidarymas. |
Santrauka - PGR ir DNR sekos nustatymas
PGR ir DNR sekos yra labai svarbios priemonės daugelyje molekulinės biologijos sričių. DNR fragmentų amplifikacija atliekama PGR metodu, o DNR seka nustatoma teisinga DNR fragmentų nukleotidų tvarka. Tai yra skirtumas tarp PGR ir DNR sekos.
